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柱層析硅膠的柱層析使用注意事項


1.柱層析的使用操作
1.1.裝柱:裝柱的方法分濕法和干法兩種。實驗室濕法裝柱時,將柱豎直固定在鐵支架上,關閉活塞,加入選定的流動相溶劑至柱容積的1/4 ,用一支干凈的玻璃棒將少量玻璃毛(或脫脂棉)輕輕推入柱底狹窄部位,小心擠出其中的氣泡,但不要壓得太緊密,否則流動相溶劑將流出太慢或根本流不出來。將準備好的白沙加入柱中,在玻璃毛上均勻沉積成約5mm厚的一層。將需要量的吸附劑置燒杯中,加流動相溶劑浸潤,溶脹并調成糊狀。打開柱下活塞調節流出速度為每秒鐘1滴,將調好的吸附劑在攪拌下自柱頂緩緩注入柱中,同時用套有橡皮管的玻璃棒輕輕敲擊柱身,使吸附劑在流動相溶劑中均勻沉降,形成均勻緊密的吸附劑柱。吸附劑一次加完。若分數次加,則會沉積為數層,全部吸附劑加完后,在吸附劑沉積面上蓋一層白沙(如柱很小,也可不用白沙而蓋上一張直徑與柱內徑相當的濾紙片),關閉活塞。在全部裝柱過程及裝完柱后,都需始終保持吸附劑上面有一段液柱,否則將會有空氣進入吸附劑,在其中形成氣泡而影響分離效果。如果發現柱中已經形成了氣泡,應設法排除,若不能排除,則應倒出重裝。
干法裝柱時,先將柱豎直固定在鐵支架上,關閉活塞。加入溶劑至柱容積的3/4,打開活塞控制溶劑流速為1滴/秒,然后將所需量的吸附劑通過一支短頸玻璃漏斗慢慢加入柱中,同時,輕輕敲柱身使柱填充緊密。干法裝柱的缺點是容易使柱中混有氣泡。
1.2加樣:加樣也分干法、濕法兩種。
濕法加樣是將待分離物溶于盡可能少的溶劑中,打開柱下活塞小心放出柱中液體至液面下降到濾紙片處,關閉活塞,將配好的溶液沿著柱內壁緩緩加入,開啟柱下活塞,放出液體至溶液液面降至濾紙片時,關閉活塞,用少許溶劑沖洗柱內壁(同樣不可擾動吸附劑),再放出液體至液面降到濾紙處,再次沖洗柱內壁,直至柱壁和柱頂溶劑沒有顏色。加樣操作的關鍵是要避免樣品溶液被沖稀。
干法加樣是將待分離樣品加少量低沸點溶劑溶解,再加入約5倍量吸附劑,拌和均勻后在通風櫥中蒸發至干。揭去柱頂濾紙片,將吸附了樣品的吸附劑平攤在柱內吸附劑的頂端,在上面加蓋濾紙片或加蓋一層白沙。干法加樣易于掌握,不會造成樣品溶液的沖稀,但不適合對熱敏感的化合物。
1.3淋洗和接收:
樣品加入后即可用大量流動相溶劑淋洗。隨著流動相向下移動,混合物逐漸分成若干個不同的色帶,繼續淋洗,各色帶間距離拉開,最終被一個個淋洗下來。當第一色帶開始流出時,更換接收瓶,接收完畢再更換接受瓶,接受兩色帶間的空白帶,并依此法分別接收各個色帶。若后面的色帶下行太慢,可依次使用幾種極性逐漸增大的流動相溶劑來淋洗。

1.4分離收集物檢測:分離無色物質時需要檢測,實驗室一般檢測為顯色或采用HPLC等分析儀器直接檢測。

柱層析硅膠的柱層析使用注意事項

常用的辦法是等分接收,即事先準備十幾個甚至幾十個接收瓶,依次編出號碼,各接收相同體積的流出液,并各自在薄層板上點樣展開,然后在薄層板上顯色。具有相同Rf值的為同一組分,可以合并處理。也可能出現交叉帶,若交叉帶很少,可以棄之,若交叉帶較多,或樣品很貴重,可以將交叉部分再次作柱層析分離,直至完全分開。同理采用分析儀器檢測的直接對接收的流出液檢測即可。
2.柱層析使用注意事項
2.1要控制流動相溶劑流出的速度。若流速太快,柱層析硅膠樣品在柱中的吸附和溶解過程來不及達到平衡,影響分離效果。若流速太慢,分離時間會拖得太長。有時,樣品在柱中停留時間過長,可能促成某些成分發生變化,或流動相在柱中下行速度小于樣品的擴散速度,會造成色帶加寬、交合甚至根本不能分離。2.2以下現象會嚴重影響分離效果,必須盡力避免。2.2.1色帶過寬,界限不清:造成的原因可能是柱的直徑與高度比選擇不當,或吸附劑、流動相溶劑選擇不當,或樣品在柱中停留時間過長。但更常見的卻是在加樣時造成的。若在樣品溶液加進柱中后,沒有打開下部活塞放出流動相溶劑使樣品溶液降至濾紙片處,即急于加溶劑沖洗柱壁,造成樣品溶液大幅度稀釋,或過早加大量溶劑淋洗,必然會造成色帶過寬。所以溶樣時一定要使用盡可能少的溶劑,加樣時一定要避免樣品溶液的稀釋。2.2.2色帶傾斜:正常情況下柱中的色帶應是水平的,如圖1-a 所示。而傾斜的色帶如圖1-b所示,在前一個色帶尚未完全流出時,后面色帶的前沿已開始流出,所以不能接收到純粹的單一組分。造成色帶傾斜的原因是吸附劑的頂面裝得傾斜,或柱身安裝得不垂直。2.2.3氣泡:當柱內有氣泡時,大量流動相溶劑順氣泡外壁流下,在氣泡下方形成溝流,使后一色帶前沿的一部分突出伸入前一色帶(見圖1-c),從而使兩色帶難于分離。所以在裝柱及淋洗過程中應始終保持吸附劑上面有一段液柱。

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